Στάδιο 1 – Κατασκευή και χαρακτηρισμός 3D ικριωμάτων.
Α. Τροποποίηση CNP υψηλής καθαρότητας: Τα CNP που Θα χρησιμοποιηθούν για την ενίσχυση των ικριωμάτων θα είναι CNTs ή GNPs ή GOs υψηλής καθαρότητας, έως 98.5%. Το πρώτο στάδιο χημικής τροποποίησης των CNP περιλαμβάνει τη δημιουργία ομάδων καρβοξυλίου (-COOH), με χρήση πρωτοκόλλων οξείδωσης με οξέα ή συνδυασμούς οξέων (HNO3, HCl, H2SO4 και H2O2, διάλυμα πιράνχα, βασιλικό νερό). Θα γίνει ανάπτυξη και βελτιστοποίηση πρωτοκόλλων χημικής τροποποίησης των CNP με χιτοζάνη (CNP-CS). Τα συζεύγματα CNP-CS θα παρασκευαστούν με βάση επιτυχημένα βιβλιογραφικά πρωτόκολλα, τα οποία θα τροποποιηθούν κατάλληλα και θα βελτιστοποιηθούν για τη σύνδεση CS διαφόρων μοριακών βαρών. Θα παρασκευαστούν διάφορα μίγματα διασποράς των CNP-CS σε διαλύματα κατάλληλων BRPs όπως π.χ. PCL, PLA, PVA, με σκοπό τον προσδιορισμό του καταλληλότερου μίγματος CNP-CS/BRP που θα χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια για την κατασκευή του 3D ικριώματος με τις μεθόδους της ηλεκτροϊνοποίησης και της 3D εκτύπωσης. Όλα τα υλικά με βάση τα CNP που θα παραχθούν θα χαρακτηριστούν με τις κατάλληλες αναλυτικές μεθόδους μεταξύ των οποίων η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM), η Φασματοσκοπία Raman, η Θερμοβαρυμετρική Ανάλυση (TGA) και η Φασματοσκοπία Διασποράς Ενέργειας ακτινών-Χ (EDX), Φασματοσκοπία Υπέρυθρου (IR).
Β. Κατασκευή 3D ικριωμάτων με ηλεκτροϊνοποίηση/ Παραγωγή σύνθετων νανοϊνών από CNP-CS/BRP: Θα καθοριστούν αρχικοί συνδυασμοί παραμέτρων της ηλεκτροϊνοποίησης για κάθε συνδυασμό των πολυμερικών διαλυμάτων (ηλεκτρική τάση συνεχούς (DC), απόσταση βελόνας – συλλέκτη (10-25 cm), ρυθμός ογκομετρικής παροχής του διαλύματος) ώστε να επιτευχθεί βελτιστοποίησή των χαρακτηριστικών του ικριώματος σε σχέση με τις αρχικές επιδιώξεις: Το πορώδες θα επιδιωχθεί να είναι όσο μεγαλύτερο γίνεται, έτσι ώστε οι πόροι να αλληλοσυνδέονται, αλλά τα ικριώματα να έχουν ικανοποιητική δυσκαμψία. Για την επίτευξη μεγέθους πόρων ως 300 μm θα χρησιμοποιηθεί κατάλληλα δομημένο ατσάλινο πλέγμα ως ειδικός συλλέκτης στην ηλεκτροϊνοποίηση. Θα δημιουργηθούν μεμβράνες με τυχαίο προσανατολισμό ινών ή με παράλληλες ίνες, που θα παρασκευαστούν με κατάλληλα περιστρεφόμενο συλλέκτη (dram) με ρύθμιση της συχνότητας περιστροφής του. Τα 3D ικριώματα θα γίνουν με εναπόθεση διαφορετικών μεμβρανών και συγκόλληση της μίας πάνω στην άλλη (layer-by-layer assembly), ή εναλλακτικά με τύλιγμα μεμβρανών, πάχους τουλάχιστον 3-5 mm.
Γ. Κατασκευή 3D ικριωμάτων με 3D εκτύπωση/ Κατασκευή νανο-τροποιημένου νήματος πολυμερών: Με την 3D εκτύπωση, θα παρασκευαστούν ικριώματα που θα περιέχουν διαφορετικά ποσοστά CNP-CS με τη μέθοδο της τηκόμενης ανάμιξης (melt blending) η οποία επιτυγχάνεται μέσω εξώθησης χρησιμοποιώντας τον extruder Composer 450. Η ανάμιξη των CNP με τα πολυμερή γίνεται με μηχανικό τρόπο, και πραγματοποιείται σε αργές στροφές εν ψυχρώ και για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα ώστε να επιτευχθεί μια αρχική ομοιογένεια στο μίγμα. Λόγω της ίδιας μορφής των επιμέρους συστατικών (σκόνη) το μίγμα είναι σταθερό, ομοιογενές και μπορεί να εισαχθεί στον extruder. Από την εξώθηση το υλικό προκύπτει σε μορφή νήματος το οποίο εν συνεχεία τεμαχίζεται σε μορφή pellet. Τα παραχθέντα pellet ανατροφοδοτούνται στον εξωθητή για τουλάχιστον μία φορά με σκοπό την βελτίωση της ομοιογένειας του νανο-τροποποιημένου μίγματος. Ανάλογα με τον τύπο του/των αρχικού/ων πολυμερούς/ών και των CNPs, καθώς και της περιεκτικότητάς τους, ο αριθμός των ανατροφοδοτήσεων θα ποικίλει και θα προσδιορίζεται ύστερα από τη διεξαγωγή ποιοτικού ελέγχου του υλικού. Το παραγόμενο νανο-τροποποιημένο νήμα θα χρησιμοποιείται ως υλικό τροφοδοσίας 3D εκτυπωτή για την υλοποίηση της επόμενης φάσης της παραγωγής ικριωμάτων.
3D εκτύπωση: Το ικρίωμα θα σχεδιάζεται σε κατάλληλο σχεδιαστικό πρόγραμμα. O σχεδιασμός της δομής του ικριώματος προβλέπει κλιμακωτή αύξηση των πόρων καθ’ ύψος. Ακολούθως επιλέγονται οι κατάλληλες ρυθμίσεις για την εκτύπωση του ικριώματος χρησιμοποιώντας το νανο-τροποποιημένο νήμα. Η εκτύπωση θα πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας τον εκτυπωτή Edison AEP. Η παρατήρηση και ο έλεγχος των δειγμάτων καθώς και ο προσδιορισμός της διαμέτρου των πόρων τους πραγματοποιείται μέσω οπτικής μικροσκοπίας και κατάλληλου λογισμικού ανάλυσης.
Δ. Χαρακτηρισμός των 3D ικριωμάτων: περιλαμβάνει τον έλεγχο της νανο- και μικροδομής, των μηχανικών χαρακτηριστικών και της βιοδιάσπασης in-vitro: Η μικροδομή θα προσδιοριστεί με μικροανάλυση SEM/ΤΕΜ καθώς και με συνεστιακή μικροσκοπία. Η μορφολογία της επιφάνειας των ικριωμάτων σε μικρο/νανο – επίπεδο, καθώς και οι επιφανειακές μηχανικές ιδιότητες τους, θα προσδιοριστούν με Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης σε συνδυασμό με την τεχνική της νανοεισχώρησης (nanoindentation). Τα μηχανικά χαρακτηριστικά θα προσδιοριστούν με μηχανικές δοκιμές σε θλίψη και κάμψη τριών σημείων. Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί μελέτη των θερμο-μηχανικών ιδιοτήτων των υλικών μέσω Δυναμικής Μηχανικής Ανάλυσης (DMA). Τέλος, θα μελετηθούν τα θερμικά χαρακτηριστικά των υλικών (σημείο τήξης κτλ.) μέσω Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC). Η βιοδιάσπαση των 3D πολυμερών θα γίνει in-vitro σε θερμοελεγχόμενα υδατόλουτρα σε 37°C, φυσιολογικό pH και συγκεντρώσεις ηλεκτρολυτών. Θα προσδιορίζεται η απώλεια μάζας με τον χρόνο καθώς και οι μεταβολές στην δομική ακεραιότητα και τη μηχανική συμπεριφορά, συγκριτικά με τα αρχικά δοκίμια.
Στάδιο 2 – Φόρτωση των 3D ικριωμάτων με BMP-2, και/ή VEGF-A και/ή αντίσωμα για την πρωτεΐνη ΜΚ
Ανάμεσα στις διαφορετικές 2D μεμβράνες των ηλεκτροϊνοποιημένων ικριωμάτων θα ενσωματωθούν πολυμερή (άλας αλγινικού οξέος ή ηπαρίνη ή υαλουρονικό οξύ) που θα περιέχουν διαφορετικές συγκεντρώσεις anti-MK, έτσι ώστε να επιτευχθεί αργή και παρατεταμένη απελευθέρωση του αντισώματος. Όταν ολοκληρωθεί η κατασκευή των ικριωμάτων(και με τις δυο μεθόδους), θα διαβρέχονται και θα επωάζονται για 24 ώρες υπό στείρες συνθήκες, με διαλύματα που θα περιέχουν BMP-2 και/ή VEGF σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Η κάλυψη των ικριωμάτων με τους παράγοντες αυτούς μπορεί να εκτιμηθεί με τη χρήση παραγόντων σημασμένων με FITC ή με τη χρήση εκλεκτικών, κατάλληλα σημασμένων αντισωμάτων. Ο ρυθμός απελευθέρωσης του anti-MK από το βιοπολυμερές στο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας θα αξιολογηθεί πριν την κάλυψη των ικριωμάτων με κύτταρα, με τη χρήση κατάλληλης ELISA. Η διατήρηση της ικανότητας του anti-ΜΚ που απελευθερώνεται από το ικρίωμα να επάγει την έκφραση οστεογενετικών δεικτών θα μελετηθεί σε καλλιέργειες οστεοβλαστών in-vitro. Η δράση θα συγκριθεί με τη δράση της ίδιας συγκέντρωσης anti-MK που θα χορηγηθεί απευθείας στα κύτταρα.
Στάδιο 3 – Βιολογική αξιολόγηση των 3D ικριωμάτων in-vitrο
Τα 3D ικριώματα θα τροφοδοτηθούν με πρόδρομα μεσεγχυματικά κύτταρα από ανθρώπινο ομφάλιο λώρο (human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSC) και ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC). Η καλλιέργεια των υβριδικών αυτών δοκιμίων θα γίνει σε βιοαντιδραστήρα διάχυσης. Θα μελετηθούν τέσσερεις ομάδες: hUCMSC στο ικρίωμα σε στατικές συνθήκες, hUCMSC στο ικρίωμα με εφαρμογή μηχανικού ερεθίσματος, συγκαλλιέργεια hUCMSC και HUVEC στο ικρίωμα σε στατικές συνθήκες, συγκαλλιέργεια hUCMSC και HUVEC στο ικρίωμα με εφαρμογή μηχανικού ερεθίσματος. Η στατική καταπόνηση περιλαμβάνει μόνο την ανάπτυξη διατμητικών δυνάμεων στα κύτταρα, λόγω της ροής του θρεπτικού μέσου μέσω των πόρων του ικριώματος. Η μηχανική καταπόνηση περιλαμβάνει επιπλέον κυκλική θλιπτική καταπόνηση των δοκιμίων, η οποία θα εφαρμόζεται για σύντομα χρονικά διαστήματα σε διαφορετικές χρονικές περιόδους της καλλιέργειας. Θα γίνει βελτιστοποίηση των πρωτοκόλλων τροφοδοσίας των κυττάρων στα ικριώματα και της αναλογίας τους σε συγκαλλιέργεια, και των παραμέτρων του μηχανικού ερεθίσματος για την επαγωγή της οστεογένεσης. Η προσκόλληση, ο πολλαπλασιασμός και η επιβίωση των κυττάρων θα μελετηθούν με βάση προτυπωμένες μεθόδους και ολοκληρωμένα συστήματα, σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα. Η διαφοροποίηση των hUCMSC θα μελετηθεί σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα μετά την προσθήκη στην καλλιέργεια παραγόντων διαφοροποίησης με τη μέτρηση: α) της ενεργότητας της αλκαλικής φωσφατάσης με κατάλληλο ολοκληρωμένο σύστημα, β) της εναπόθεσης ασβεστίου με Alizarin Red S και γ) της έκφρασης γονιδίων χαρακτηριστικών των οστεοβλαστών με RT-PCR. Σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (με μέγιστο 21 ημέρες), θα ελεγχθεί και θα ποσοτικοποιηθεί ο σχηματισμός νέου οστού με ιστομορφομετρία, καθώς και η βιοδιάσπαση του ικριώματος. Ο σχηματισμός αυλών από τα κύτταρα HUVEC στα ικριώματα θα μελετηθεί σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (με μέγιστο 21 ημέρες) με τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων για εκλεκτικούς δείκτες ενδοθηλιακών κυττάρων (π.χ. CD31) και συνεστιακό μικροσκόπιο. Η ποσοτικοποίηση θα γίνει με τη χρήση κατάλληλου λογισμικού ανάλυσης εικόνας.
Στάδιο 4 – Βιολογική αξιολόγηση των 3D ικριωμάτων in-vivo
Θα πραγματοποιηθεί πειραματική μελέτη των μηχανικών και γεωμετρικών χαρακτηριστικών του ικριώματος στην πλήρωση οστικών ελλειμμάτων των μακρών οστών. Θα χρησιμοποιηθούν άρρενες επίμυες της φυλής Wistar, βάρους περίπου 250gr o καθένας, οι οποίοι θα χωριστούν σε 2 ομάδες αποτελούμενες από 10 επίμυες η κάθε μία. Τα πειραματόζωα θα τοποθετούνται σε ειδικά πλαστικά κλουβιά ανά δυο με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό σε χώρο με κυκλική εναλλαγή ημέρας και σκότους και σταθερή θερμοκρασία περίπου στους 24°C. Η αναισθησία των Βιομιμητικά νανοσύνθετα 3D ικριώματα για αναγέννηση οστού πειραματοζώων θα πραγματοποιηθεί με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση κεταμίνης 100mg/ml. Στην πρώτη ομάδα θα δημιουργηθεί οστικό έλλειμμα στο μηριαίο όστο το οποίο θα πληρωθεί με το παρασκευασμένο ικρίωμα. Θα ακολουθήσει σύγκλιση του τραύματος με απορροφήσιμα ράμματα. Στη δεύτερη ομάδα (control group) θα ακολουθηθεί ακριβώς η ίδια διαδικασία με τη διαφορά ότι το οστικό έλλειμμα δε θα πληρωθεί από το ικρίωμα. Θα εκτιμηθεί συγκριτικά ο χρόνος πλήρωσης των οστικών ελλειμμάτων κάθε 2 εβδομάδες με ακτινολογικό έλεγχο.
Στάδιο 5 – Αριθμητική αξιολόγηση ικριώματος
Θα πραγματοποιηθεί παραμετρική μελέτη των μηχανικών και γεωμετρικών χαρακτηριστικών του ικριώματος σε επίπεδο νανο-, μικρο- και μακροδομής. Θα γίνει σχεδιασμός της γεωμετρίας του ικριώματος και ανάπτυξη 3D αριθμητικού μοντέλου για την αριθμητική αξιολόγηση των παραμέτρων που περιγράφηκαν στο Στάδιο 1 και την επικύρωση των αποτελεσμάτων της βιολογικής και πειραματικής αξιολόγησης (Στάδιο 3,4). Οι κύριες παράμετροι ενδιαφέροντος είναι το μέγεθος των πόρων, το πορώδες, ο προσανατολισμός ινών και η εναπόθεση-πάχος στρώσεων. Θα αξιολογηθούν τα μηχανικά χαρακτηριστικά σε θλίψη μέσω της μελέτης των τάσεων-παραμορφώσεων του υλικού χρησιμοποιώντας τη μέθοδο πεπερασμένων στοιχείων που είναι μια αριθμητική μέθοδος για τον υπολογισμό προσεγγιστικών λύσεων μερικών διαφορικών εξισώσεων. Επιπλέον, το στάδιο αυτό περιλαμβάνει την αριθμητική αξιολόγηση του πολλαπλασιασμού κυττάρων, της οστεογένεσης και αγγειογένεσης. Θα γίνει ανάπτυξη μαθηματικών μοντέλων για την προσομοίωση του προβλήματος του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της οστεογένεσης και αγγειογένεσης που δεν είναι εφικτό να αξιολογηθεί ποιοτικά και ποσοτικά μέσω της πειραματικής αξιολόγησης. Για τα προτεινόμενα μοντέλα θα περιγραφούν τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά της οστικής επούλωσης στην περιοχή του οστικού ελλείμματος όπου τοποθετείται το ικρίωμα και αρχίζει με τη μετανάστευση των μεσεγχυματικών και ενδοθηλιακών κυττάρων και την απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων. Οι παράμετροι που αναλύονται στο Στάδιο 3 θα αποτελέσουν τις κατευθυντήριες γραμμές για την ανάπτυξη των αριθμητικών μοντέλων. Τα αποτελέσματα της αριθμητικής επίλυσης θα περιγράφουν την χωροχρονική εξέλιξη ινώδους ιστού, χόνδρου, οστικού ιστού, αγγείων και τον ρόλο του αντισώματος anti-MK και του αυξητικού παράγοντα VEGF.
